Методика приготовления временных микропрепаратов. Техника изготовления временных микропрепаратов Почему микропрепарат помещают в каплю воды

Первым шагом на пути к изучению микромира, безусловно, является выбор и покупка самого микроскопа. И если же Вам посчастливилось справиться с этим нелегким делом, Вы выбрали, какой купить микроскоп, а, может быть, уже и купили его, то можно сказать, что Вы уже практически на полпути к своей цели. И вот Вы уже достали микроскоп из коробки, собрали его, установили, настроили…, а что же делать дальше? А дальше Вам предстоит проделать немалый труд, ведь, чтобы приблизиться к миру науки, оказывается, недостаточно просто , а нужно еще научиться готовить препараты для исследования под микроскопом.

Многие производители оптических приборов выпускают детские микроскопы с уже готовыми препаратами в комплекте. Также сегодня можно купить и различные наборы готовых препаратов, так называемых слайдов, по 10, 25, 50 и даже 100 штук стеклышек разных тематик. И хотя такие наборы сравнительно недешевое удовольствие, тем не менее, они могут оказаться очень интересными и полезными как для ребенка, так и для студента медицинского института, ведь многие из препаратов просто нереально приготовить в домашних условиях.

Так среди готовых препаратов Вы можете найти образцы бактерий, срезы легких, печени, кожи человека и животных и прочие интересные образцы, которые не так уж легко, а то и вообще невозможно встретить в повседневной жизни.

Но, помимо подобных готовых препаратов, Вы можете также исследовать и различные объекты, доступные в домашних условиях. Для приготовления объектов для исследования под микроскопом Вам понадобятся предметное и покровное стекло, которые можно купить в магазинах оптических приборов.

Одним из наиболее популярных образцов, которые Вы сможете самостоятельно приготовить – это пленочка лука. Для этого сначала необходимо очистить лук от сухой шелухи, а затем аккуратно (можно с помощью пинцета) снять тонкую пленочку. На предметное стекло необходимо капнуть несколько капель воды, а затем аккуратно разместить на нем пленочку лука. Если пленочка немного скомкалась, возьмите иголочку и расправьте ею образец на стекле. После этого с помощью пипетки капните каплю раствора йода и накройте образец покровным стеклом.

Подобным образом Вы можете приготовить еще массу различных образцов из растений, овощей и пр. Следует помнить, что при исследовании объекта под биологическим микроскопом необходимо брать плоские прозрачные предметы. Биологические микроскопы предназначены для исследования в проходящем свете и имеют нижнюю подсветку, поэтому срезы растений должны быть как можно тоньше и аккуратнее. С этой целью был изобретен такой прибор, как микротом. Микротом – это такой инструмент, с помощью которого можно легко приготовить очень тонкие срезы биологических тканей. Так в комплект ко многим детским микроскопам входят микротомы, конечно же, не профессиональные, а более безопасные для Вашего малыша. Но даже если в Вашем распоряжении среди аксессуаров для препарирования нет микротома, Вы можете воспользоваться обычным лезвием или канцелярским ножом. Не стоит забывать о мерах предосторожности и безопасности Вашего ребенка, поэтому лучше не позволяйте малышу брать лезвие, нож или микротом без Вашего присмотра.

При приготовлении различных образцов Вам также могут понадобиться красители, в качестве которых Вы можете использовать раствор йода, водный раствор метиленового синего (проще говоря, «синьки»), эозина и пр.

Также Вы можете исследовать под микроскопом кристаллы сахара, соли, корень волоса, плесень (например, вырастить в чайнике чайную плесень).

Если приготовленный образец Вам не очень понравился, Вы можете попробовать очень аккуратно разъединить покровное и предметное стекло (такие препараты, которые не закрепляются надолго, называются временными), промыть их, вытереть, высушить и использовать в дальнейшем для приготовления других препаратов. Будьте особенно осторожны, так как покровные и предметные стекла очень тонкие и хрупкие, легко трескаются, а также не давайте детям играться со стеклами. Если же Вы хотите сохранить этот препарат, то перед тем, как накрывать его покровным стеклом, капните немного закрепителя (напр. пихтовую смолу или прозрачный клей) по краям образца (такой препарат будет называться постоянным). Затем придавите его и дайте высохнуть (около суток).

Вот теперь, после того как Вы успешно выполнили и этот шаг, можно приступать к самому процессу наблюдения и исследования! Желаем Вам успехов!

Приложения

Правила приготовления микропрепаратов

Для приготовления временных микропрепаратов необходимо иметь набор предметных и покровных стекол, препаровальные иглы, лезвия бритвы, скальпели, стеклянные палочки для воды, пипетки, пинцеты, фильтровальную бумагу, некоторые реактивы, бинокулярные лупы, микроскопы.

Предметное и покровное стекла промывают водой и протирают досуха салфеткой из мягкой ткани. Тонкий срез растительного объекта помещают в каплю воды на предметное стекло и накрывают покровным стеклом. Если жидкость на препарате выступает за края покровного стекла, то излишек ее удаляют полосками фильтровальной бумаги. Когда вода не покрывает всю площадь под покровным стеклом, пипеткой наносят близ края покровного стекла еще каплю, которая сама втягивается под стекло.

Для изучения живых клеток применяют метод висячей и раздавленной капли. Последний заключается в прижимании покровного стекла к предметному и удалении избытка воды фильтровальной бумагой.

Масса, зафиксированная на предметном стекле, получила название мазка. На обезжиренное предметное стекло наносят каплю с изучаемым объектом и размазывают покровным и фиксируют высушиванием.

При необходимости введения какого-либо красящего реактива воду из-под покровного стекла удаляют с помощью фильтровальной бумаги, а капельку реактива наносят с противоположной стороны в край покровного стекла.

Реактивы, используемые в работе:

1) анилиновый синий в молочной кислоте. 0,1 г анилинового синего растворяют в 100 мл воды, добавляют 50 мл молочной кислоты. Употребляется для выявления мицелия в тканях растений;

2) глицерин используется для просветления препарата;

3) едкая щелочь (КОН) используется в виде 5-10%-х водных растворов. Используется как средство, способствующее набуханию высохших оболочек (споры грибов) и просветляющее препараты;

4) иммерсионное масло представляет собой очищенное и сгущенное кедровое масло. Применяется для рассмотрения препаратов с объективом ×90. Каплю масла помещают между объективом и покровным стеклом микропрепарата;

5) йод употребляется обычно в виде раствора Люголя (1 г кристаллического йода, 2 г йодистого калия и 300 мл воды). Вначале готовят раствор йодистого калия в воде и вносят навеску йода. Служит для окрашивания зерен крахмала
и гликогена в клетках;

6) медный купорос (СuSO 4 ) используется для приготовления фелинговой жидкости и при получении абсолютного спирта;

7) «Судан III » окрашивает жиры, смолы, эфирные масла в красный цвет. Раствор красителя всегда должен быть свежеприготовленным: 0,1 г «Судана III»
растворяется в 20 мл 95%-го спирта, после чего к раствору добавляется 20 мл глицерина.

Техника приготовления временных микропрепаратов

1. Микропрепараты готовят путем помещения объектов в каплю воды на предметном стекле, тщательно расправляя их с помощью препаровальных игл
и накрывая покровным стеклом. Избыток воды удаляется фильтровальной бумагой.

2. Приготовленный препарат рассматривается вначале при малом (×8, ×20),
а затем при большом (×40, ×60, ×90 с иммерсией) увеличении микроскопа с осветителем. При использовании иммерсионной системы микроскопа на препарат наносят каплю кедрового масла и рассматривают без покровного стекла.

3. Рассматриваемые объекты зарисовываются и подписываются.

4. Узнать увеличение микроскопа, при котором рассматривается тот или иной объект, просто. Для этой цели необходимо умножить цифру, стоящую на объективе, на цифру, обозначенную на окуляре (эта цифра всегда со знаком ×). Например, при объективе 40 и окуляре ×10, микроскоп дает увеличение в 400 раз.

Техника выполнения биологического рисунка

Зарисовке ботанических объектов нужно уделять серьезное внимание, так как это не только способ оформления результатов наблюдения, но и метод эксперимента, позволяющий более детально изучить объект.

1. Рисунок должен быть четким, пропорциональным, правильно отражать результаты наблюдений, трактовку исследованных структур.

2. Схему строения таллома рисуют при малом, а детальное строение отдельных клеток при большом увеличении микроскопа.

3. Располагают рисунок с левой стороны листа.

4. На правую сторону выносят стрелки с цифрами и расшифровывают их
в подрисуночной подписи.

5. Рисунок должен быть крупным (не более двух на листе). Делают его простым карандашом.

Приложение 2

Сбор, обработка и гербаризация водорослей

Водоросли можно собирать в любое времягода, но лучше в весенние, летние и осенние месяцы. Различают водоросли, обитающие в воде и вне воды (на коре стволов деревьев, почве, влажных стенах, заборах, снегу, льду, у сточныхтруб
и т. д.). Под фитопланктоном в науке понимают группу микроскопических растений, которые обитают в воде.Большинство из них имеет специальные приспособления, чтобы держаться в воде во взвешенномсостоянии (выделение слизи, газовые вакуоли, каплижира и т. д.).

Некоторыепланктонные водоросли способны кпередвижению при помощи жгутиков. Бентосныеводоросли представлены нитчатками, которыми обрастают различные подводные предметы, и формами, обитающими на грунтах водоемов.

Тину можно собирать из воды с помощью палки с набитыми на ней несколькими гвоздями или с помощью «кошки», состоящей из крупного рыболовного крючка, грузила и прочной бечевки. Пробы ила, в которых обитает много видов водорослей, можно брать с помощью металлической ложки, предварительно отточив одни из ее краев.

Для сбора планктонных водорослей используется планктонная сетка. Она состоит из конусовидного сачка, изготовленного из специальной шелковой или другой тонкой и плотной ткани. Внизу к узкой части сачка прикрепляется металлическая или стеклянная воронка с резиновой трубкой и зажимом.

Аэрофильные водоросли, обитающие на коре стволов деревьев, можно собирать, срезая острым ножом тонкие кусочки коры.

Собранный материал этикетируется. На этикетках пишется дата и место сбора, отмечается характер водоема (чистый, загрязненный и т. д.). В сосудах с пробами должно быть достаточно воды и значительное количество водорослей для лучшей сохранности в живом состоянии. Хорошо сохраняется материал для дальнейших исследований в кристаллизаторах, покрытых стеклами. Многие водоросли таким способом сохраняются в лаборатории в живом состоянии довольно долго (пиннулярия, осциллятория и др.). Водоросли можно собирать и хранить в баночках емкостью 50 см 3 , бутылках и т. д. Если собранный материал необходимо сохранить продолжительный срок, его консервируют. Обычно для этого используют 40%-й формалин, разбавляя его в 10 раз. Банки с пробами после добавки формалина взбалтывают и плотно закрывают, хранят в темном шкафу.

Некоторые водоросли можно долгое время сохранять в сухом состоянии. Например, зеленые налеты со стволов деревьев, срезанные вместе с корой, помещают в коробки с этикетками. Гербарий можно сделать из нитчаток. Для этого зеленые или сине-зеленые нитчатки помещают в таз с водой, под них подводят лист белой плотной бумаги. Нити аккуратно расправляют препаровальной иглой,
а затем бумагу с водорослями вынимают из воды и высушивают на воздухе.

Для сохранения гербарных листов от пыли и порчи их помещают в целлофановые пакеты или кладут в конверты. В каждый конверт кладется один или
несколько гербарных листов с водорослями одного рода. На конверте делается соответствующая надпись.

Сбор, обработка и составление коллекций грибов

Коллекции грибов составляются для научного изучения, для краеведческого музея, где можно ознакомиться с микобиотой своего района, для демонстрации на занятиях в вузе и на уроках в школе. К сбору грибов студенты должны подготовить соответствующее снаряжение: корзинку, нож с широким лезвием для выкапывания гриба или срезания его с субстрата, бумагу, в которую отдельно заворачивается каждый вид гриба, и коробки, в которые помещаются плодовые тела зрелых (пылящих) гастеромицетов. Бумагу лучше заранее нарезать на куски размером 20×20 или 25×30 см. Можно свернуть ее в виде конвертов. Необходимы также дневник для описания маршрута и мест сбора отдельных видов грибов, особенностей собранных образцов, нарезанная бумага для этикеток, карандаш. Хорошо иметь линейку или ленту для измерения плодового тела и стандартную шкалу цветов для точного определения цвета грибов. Все это лучше делать на месте сбора.

Собранные грибы укладывают в корзинку таким образом, чтобы они не помялись и не поломались. Для высушивания их помещают на металлические сетки или на обычные гербарные сетки вместе с этикетками или номерами этикеток так, чтобы этикетки не перепутались и не мешали высушиванию.

Сетки выставляют на солнце, помещают над плитой, электрической плиткой
и т. д. Мелкие и тонкомясистые грибы можно сушить просто в комнате, разложив их на бумаге. Очень мясистые и крупные плодовые тела можно разрезать пополам. Лучшая температура для высушивания плодовых тел средних размеров (диаметр шляпки 5-7 см) - 35-45 °С. Рекомендуется отдельно от мясистых сушить все мелкие и тонкие, легковысыхающие грибы.

Коллекцию сухих грибов необходимо обработать инсектицидами. После
дезинфекции грибы вместе с переписанными начисто этикетками, где указаны их русское и латинское названия, можно поместить в конверты. В этом случае этикетка наклеивается сверху на конверт. Грибы можно помещать и в застекленные гербарные коробки. Их можно накалывать обыкновенными энтомологическими булавками, как это делают с насекомыми. Здесь же помещается и этикетка. Плодовые тела гастеромицетов с порошащейся глебой и легко разрушающимся эндоперидием после высушивании рекомендуется хранить в коробках, помещая в них конверт с образцом. Крупные плодовые тела гастеромицетов необходимо хранить в коробке целиком, не разрезая. В гербарную коробку или конверт кладется
немного нафталина (в марлевом мешочке или небольшой открытой пробирке), чтобы предохранить коллекцию от вредителей. Очень хорошо поместить рядом
с грибом и его споровый отпечаток, который позволит всегда иметь представление о цвете его спор и зрелых пластинок.

Приложение 3

Ключ для определения водорослей

1. Таллом неклеточный.............................................................................................2

Таллом клеточной организации..........................................................................3

2. Водоросль не имеет поперечных перегородок. - Вошерия - Vaucheria .

Таллом поделен поперечными перегородками на неравновеликие сегменты.

- Кладофора - Cladophora .

3. - Таллом представлен одной клеткой (одноклеточные организмы)………..4

Таллом включает более одной клетки.............................................................13

4. Клетки монадной организации, имеют жгутики, с помощью которых передвигаются, и светочувствительный глазок (стигму)...................................................5

Клетки коккоидной организации, не имеющие жгутиков, светочувствительного глазка, неподвижные или подвижные, но тогда движение осуществляется не биением жгутиков, а другими способами...........................................................6

5. Клетки овальной формы с двумя равными жгутиками, чашевидным хроматофором, в котором расположены пиреноид и глазок. В верхней части клетки имеются пульсирующие вакуоли. Панциря нет, клетки покрыты пектиново-целлюлозной оболочкой. - Хламидомонада - Chlamydomonas .

Водоросль имеет панцирь, состоящий из отдельных щитков и несущий роговидные отростки: один верхний, длинный и два-три нижних, более коротких. - Церациум - Ceratium (отдел золотистые водоросли - Chrysophyta).

6(4).Хроматофоры зеленого цвета. Панциря нет………......................................7

Хроматофоры желтые, желто-бурые. Имеется кремнеземовый панцирь, состоящий из эпитеки и гипотеки……………………………………………………...11

7. Тело водоросли состоит из двух полуклеток, в каждой половинке по одному осевому хроматофору. При делении поперечной перегородкой каждая дочерняя особь получает одну старую полуклетку и достраивает одну новую.......................9

Тело водоросли цельное округлое или несколько овальное. Хроматофор один - чашевидный.......................................................................................................8

8. Клетки очень мелкие, в оболочке содержится спорополленин. - Хлорелла - Chlorella .

Клетки более крупные, спорополленина нет. - Хлорококкум - С hl о r ососсит.

9(7). Внешней перетяжки нет, водоросль веретеновидная, изогнутая, на концах клетки - вакуоли с кристаллами гипса. - Клостериум - Closterium .

Клетки с глубокой перетяжкой.........................................................................10

10. Полуклетки цельные, при рассмотрении сверху - эллиптические.

- Космариум - Cosmarium .

Полуклетки рассеченные, лопастные. Водоросль напоминает снежинку. - Микрастериас - Micrasterias .

11(6). Клетка со стороны створки широкоэллиптическая, шов только на одной створке. - Кокконеис - Cocconeis .

Клетки со стороны створки более узкие, шов на обеих сторонах.

Водоросль подвижна...............................................................................................12

12. Клетки асимметричные, полулунной формы, с вогнутым брюшным краем и выгнутым спинным, шов смещен к брюшному краю. - Цимбелла - Cimbella .

Клетки симметричные.......................................................................................13

13. Створки вытянутые, эллиптические, имеющие по бокам параллельную исчерченность, особенно хорошо заметную на пустых панцирях, концы клеток скруглены. - Пиннулярия - Pinnularia .

Поперечной исчерченности нет, концы клеток сужены или оттянуты. - Навикула - Navicula .

14(2). Колониальные организмы...........................................................................15

Многоклеточные организмы.............................................................................27

15. Таллом ценобиальный, число клеток постоянно. Рост водорослей за счет увеличения клеток, образовавшихся при размножении............................................16

Колонии с нефиксированным числом клеток..................................................20

16. Ценобий образован клетками монадной организации..................................17

Ценобий образован клетками коккоидной организации................................19

17. Ценобий состоит из большого числа клеток, образуя сферу, внутри которой находится слизь. Репродуктивные клетки отличаются от вегетативных. Между клетками есть плазмодесмы. - Вольвокс - Volvox .

Колонии из меньшего числа клеток. Каждая клетка может выполнять все функции. Плазмодесм нет.....................................................18

18. Внутренняя полость почти неразвита. Клетки ценобия плотно сомк нуты, отчего имеют граненую форму. Колония имеет 16 клеток. - Пандорина - Pandorina .

Внутренняя полость хорошо развита, клетки не соприкасаются и имеют сферическую форму. В колонии 32 клетки. - Эвдорина - Eudorina .

19(16). Ценобий пластинчатый.............................................................................20

Ценобий в виде сети, крупные многоядерные клетки, соединяясь своими концами, образуют пяти- или шестигранные ячейки. - Гидродикцион, (Водяная сеточка) - Hydrodiction .

20. Ценобий в виде округлых сплошных или продырявленных табличек, периферические клетки несут по два отростка. - Педиаструм - Pediastrum .

Ценобий в виде пластинок, состоящих из соединенных в один или два ряда клеток, краевые имеют длинные роговидные отростки. - Сценедесмус - Scenedesmus .

21(15). Нитчатые и цепочковидные колонии.......................................................24

Колонии иной формы.........................................................................................22

22. В состав колонии входят одноклеточные организмы....................................23

Колонии разнообразной формы образованы нитчатыми гетероцитными организмами. - Носток - Nostoc .

23. Клетки в колонии погружены в общую слизистую массу, расположены беспорядочно и изолированно. - Микроцистис - Microcystis .

Каждая клетка, входящая в слизистую колонию, покрыта собственным слизистым чехлом. При делении чехол материнской клетки сохраняется, а вокруг дочерних образуются новые обвертки. В результате нескольких делений формируется система вложенных друг в друга слизистых чехлов. - Глеокапса - Gl е ocapsa .

24(21). Водоросли зеленого цвета, колонии в виде закрученных вокруг своей оси длинных нитей, сложенных треугольными клетками. - Десмидиум - Desmidium .

Водоросли желтого цвета, хлорофилл маскируется фукоксантиом...............5

25. Клетки соединяются в колонии створками....................................................26

Створки палочкообразные, удлиненные. Колонии лентовидные. - Фрагиллярия - Fragillaria .

26. Клетки соединяются своими углами с помощью коротких слизистых тяжей. Колонии зигзагообразные....................................................................................27

Створки округлые, радиально симметричные, хроматофоры многочисленные, дисковидные или лопастные. Часто встречаются нити, содержащие бочонкообразные ауксоспоры. Колонии нитчатые. - Мелозира - Melosira .

27. Клетки колонии со стороны пояска таблитчатые, широкие за счет дополнительных ободков, хроматофор зернистый. - Табеллярия - Tabellaria .

Клетки со стороны пояска удлиненно-прямоугольные, не таблитчатые. - Диатома - Diatoma .

28(14). Многоклеточные нитчатые организмы....................................................29

Многоклеточные не нитчатые..........................................................................41

29. Таллом представлен однорядной неветвящейся нитью................................30

Таллом нитчатый ветвистый.............................................................................38

30. Хроматофоры отсутствуют, пигменты расположены на тилакоидах в хроматоплазме, окраска (синеватая, оливковая, красноватая) зависит от соотношения хлорофилла и фикобилинов (синезеленые водоросли, или цианобактерии)..........31

Хроматофоры разнообразной формы, окраска зеленая..................................34

31. Гетероцитные формы, наряду с вегетативными клетками присутствуют интеркалярные гетероцисты и крупные покоящиеся споры. Нити прямые или спиральные. - Анабена - Anabaena .

Гомоцитные формы...........................................................................................32

32. Нити спиральные. - Спирулина - Spirulina .

Нити прямые.......................................................................................................33

33. Тело водоросли покрыто массивным слизистым чехлом. - Лингбия - Lyngbia .

Четко выраженный чехол отсутствует, нити совершают колебательные движения и вращения вокруг своей оси. - Осциллятория - Oscillatoria .

34(30). Прикрепленная водоросль.........................................................................35

Свободно плавающие нити, все клетки однотипны. Половой процесс - конъюгация....................................................................................................................36

Базальные клетки образуют дланевидный ризоид, хроматофор рассеченный или сетчатый. При делении клеток образуются колпачки. - Эдогониум - Oedogonium .

35. Базальная клетка нити представляет собой бесцветный удлиненный конический ризоид. Хроматофор в виде кольцевидно изогнутой пластинки. - Улотрикс - Ulotrix .

36. Хроматофор в виде спиральной нити с городчатыми или рассеченными краями. Многочисленные пиреноиды расположены в ряд вдоль хроматофора. - Спирогира - Spirogyra .

Хроматофор не лентовидный............................................................................37

37. Хроматофор звездчатый, клетки короткие, их длина превышает ширину
не более чем в два раза. - Зигнема - Zygnema .

Хроматофор пластинчатый плоский, длина клеток во много раз превышает их ширину. - Мужоция - Mougeotia .

38(29). Водоросли зеленого цвета.........................................................................39

Водоросли не зеленые…………………………………………………………40

39. Кустики из многократно ветвящихся однорядных нитей, дифференцированных на вертикальные неограниченного роста (стволик) и горизонтальные, мутовчато расположенные, ограниченного роста (ассимиляторы). Верхушечные клетки боковых веточек видоизменены в волосок или щетинку. - Драпарнальдия - Draparnaldia .

Водоросли образуют налет кирпичного или желтого цвета (хлорофилл маскируется гематохромом) на коре деревьев. Таллом дифференцирован на стелющиеся нити из овальных или шаровидных клеток с толстой слоистой оболочкой
и вертикальные веточки, образованные длинными, несколько вздутыми клетками. - Трентеполия - Trentepohlia .

40. Хроматофоры окрашены в желто-бурый цвет (хлорофилл маскируется фукоксантином). Таллом в виде ветвящихся кустиков со стелющимися и приподнимающимися веточками. Меристематические клетки расположены в местах разветвления. Есть многокамерные и одноклеточные репродуктивные органы. - Эктокарпус - Ectocarpus .

Цвет водоросли оливковый или красный, так как хлорофилл маскируется фикобиллинами. (Красные водоросли - Rhodophyta ) ……………………………...41

41.Таллом оливкового или синевато-зеленого цвета, небольшие кустикииз вертикальных веточек и расположенных на них пучками обильно ветвящихся ассимиляторов. Центральная часть стволика обернута многочисленными гифоподобными нитями, образующими кору. Размножение моно- и карпоспорами. Ауксилярные клетки отсутствуют. - Батрахоспермум - Batrachospermum .

Обильно ветвящиеся темно-пурпурные кустики своеобразного строения. Центральный сифон окружен периферическими сифонами, отчленяющимися от клеток центральной нити. Они образуют этажи. Ауксилярные клетки образуются после оплодотворения. - Полисифония - Polysiphonia .

42(28). Крупная пресноводная водоросль, напоминающая хвощ, таллом состоит из узлов и междоузлий. - Хара - Chara .

Приложение 4

Ключ для определения представителей класса базидиомицетов:

некоторые семейства порядка афиллофоровых грибов

1. Плодовые тела пленчатые, распростертые по субстрату, коричнево-бурые до зеленовато-бурых. Обычно на толстых валежных стволах. Сем. Кониофоровые - Coniophoraceae .

Плодовые тела мягкокожистые до кожистых, тонкие, распростертые или распростерто-отогнутые, раковиновидные до почти сидячих. На ветвях лиственных пород. Сем. Гименохетовые - Hymenochaetaceae , род Гименохета - Hymenochaete .

2. На древесине. Гименофор различной формы, но не гладкий..………….........3

На почве. Гименофор различной формы…..………………………………...11

3. Гименофор трубчатый, лабиринтовидный или пластинчатый …………........4

Гименофор шиповидный; если гимений гладкий - плодовые тела коралловидно разветвленные

4. Гименофор пластинчатый, плодовые тела тонкие, раковиновидные, мягкокожистые. Сем. Щелелистниковые - Schizophylla сеае, род Щелелистник - Schizophyllum .

Гименофор трубчатый или лабиринтовидный, если пластинчатый, то плодовые тела толстые, жесткокожистые до пробково-кожистых и пробковых…..….5

5. Ткань белая, светлая или яркоокрашенная. Гименофор преимущественно трубчатый, реже лабиринтовидный до пластинчатого. Сем. Полипоровые -Polyporaceae .

Ткань, окрашенная в оттенки бурого или в ржаво-коричневый цвет. Гименофор трубчатый или пластинчатый…………………..…………………………..…6

6. Плодовые тела копытовидные, толстые, покрытые толстой светло-серой коркой. Поверхность шляпки зональная. Ткань темно-бурая. Сем. Полипоровые - Polyporaceae , род Фомес - Fomes .

Плодовые тела не имеют ярко выраженной корки или сочетание признаков иное……………………………..…………………………………………………….…7

7. Гименофор пластинчатый, плодовые тела плоские, тонкие, ткань ржаво-бурая. Сем. Полипоровые - Polyporaceae , род Глео ф иллум - Gloeophyllum .

Гименофор трубчатый….....................................................................................9

8. Плодовые тела плоские, половинчатые, сидячие, покрытые плотной матовой коркой, поверхность их часто коричневая от спорового порошка. Ткань темно-бурая, гименофор трубчатый, с почти белой поверхностью, покрывающейся пятнами при прикосновении. Сем. Ганодермовые - Ganodermataceae , плоский трутовик - Ganoderma applanatum .

Плодовые тела разупинатные, распростерто-отогнутые, сидячие, раковиновидные или копытовидные, с лишенной корки щетинистой поверхностью или покрытые неясной черноватой растрескивающейся коркой. Ткань ржаво-рыжая до рыже-бурой, поверхность гименофора одного цвета с трамой трубочек. Сем. Гименохетовые - Hymenochaetaceae , роды Феллинус - Phellinus , Инонотус - Inonotus .

9. Гименофор шиповидный. Плодовые тела распростертые или сидячие, в виде шляпок или разветвленные. Трама белая или буро-окрашенная 10

Гимений гладкий. Плодовые тела коралловидно разветвленные, отрицательно геотропичные. Сем. Рогатиковые - Clavariaceae , род Клавикорона - Clavicorona .

10. Плодовые тела резупинатные, бурые, мягкопленчатые. Сем. Гименохетовые- Hymenochaetaceae , род Астеродон - Asterodon .

Плодовые тела сидячие, черепитчато расположенные или разветвленные. Трама белая. Сем. Ежовиковые - Н ydnac е ae , роды Климакодон - Climacodon , Гериций - Hericium .

11. Плодовые тела в виде шляпки и боковой или центральной ножки. Гименофор шиповидный. На почве или на шишках хвойных. - Сем. Ежовиковые - Hydnaceae .

Плодовые тела различной формы. Гименофор трубчатый, гладкий, венозный или пластинчатый…..............................................................................................12

12. Гименофор гладкий….........................................................................................13

Гименофор трубчатый, венозный или пластинчатый….................................14

13. Плодовые тела буроокрашенные, вееровидные. На песчаной почве, часто
у корней хвойных. Сем. Телефоровые - Thelephora сеае, род Телефора - Thelephora .

Плодовые тела цилиндрические, булавовидные или коралловидно разветвленные, светлоокрашенные, трама белая. Сем. Рогатиковые - Clavariaceae .

14. Гименофор трубчатый……………………………….…………………………15

Гименофор венозный или пластинчатый. Плодовые тела светло-или темноокрашенные, воронковидные или со шляпковидно расширенной верхней частью
и пластинчатовидным гименофором. Сем. Лисичковые - С antharellace а.

15. Плодовые тела с простой или разветвленной ножкой. Трама белая. На почве, на остатках древесины, изредка на пнях. Сем. Полипоровые - Polyporaceae .

Плодовые тела с простой центральной или эксцентрической ножкой. Трама ржаво-бурая. Сем. Гименохетовые - Hymenochaeta сеае, роды Кольтриция - Coltricia .

Некоторые семейства порядка агариковых грибов

1. Гименофор трубчатый…......................................................................................2

Гименофор пластинчатый…...............................................................................3

2. Споровый порошок темно-коричневый до черного. Сем. Стробиломицетовые - Stro b ilomycetaceae .

Споровый порошок белый, розовый, желтый, оливково- или светло-коричневый. Сем. Болетовые - Boletaceae .

3. Шляпка после созревания расплывается в черную жидкость. Споры в массе черные. Сем. Навозниковые, Копринусовые - Coprinaceae .

Шляпка после созревания засыхает или загнивает, но не расплывается...…4

4. Пластинки анастомозирующие. Край шляпки подвернутый. Споровый порошок белый или светло-коричневый. Сем. Свинушковые - Рах ill асеае.

Признаки иные……….………………………………………………………....5

5. Частное и общее покрывала отсутствуют на всех стадиях развития плодового тела…………………………………………………………………………………...6

Частное или общее покрывало присутствует хотя бы на ранних стадиях развития плодового тела………………….....................................................................7

6. Плодовые тела средних или крупных размеров, с млечным соком или без него. В мякоти всегда присутствуют сфероцисты, придающие ей в зрелости слегка рассыпчатый вид или зернистость. Сем. Сыроежковые - Russulaceae .

Признаки иные. Сем. Рядовковые - Tricholomataceae (кроме родов Катателазма - Catathelasma и Армиллариела - Armillariella ).

7. Частное покрывало имеется……….…................................................................8

Частное покрывало отсутствует или быстро исчезает……………...............13

8. Частное покрывало слизистое. Сем. Мокруховые - Gomphidiaceae .

Частное покрывало иное…..................................................................................9

9. Частное покрывало паутинистое. Сем. Паутинниковые, Кортинариевые - Cortinariaceae .

Частное покрывало пленчатое, сохраняется в виде кольца на ножке.

10. Споровый порошок белый…..............................................................................11

Споровый порошок темноокрашенный….......................................................12

11. Имеются частное и общее покрывала. Род Мухомор, Аманита - Amanita из сем. Мухоморовые- Amanitaceae и род Катателазма - Catathelasma из сем. Рядовковые, Трихоломовые - Tricholomataceae .

Имеется только частное покрывало. Роды Гриб-зонтик - М acrolepiota , Ле пиота - Lepiota , Цистодерма - Cystoderma из - Agaricaceae и Армиллариелла - Armillariella из сем. Рядовковые, Трихоломовые - Tricholomataceae .

12. Споровый порошок и пластинки коричневые с лиловым оттенком. Пластинки полусвободные, приросшие или слегка нисходящие. Сем. Строфариевые - Strophariaceae .

Споровый порошок и пластинки от бурого до темно-коричневого цвета. Пластинки приросшие, с возрастом отстающие от ножки. Род Шампиньон - Agaricus , из сем. Шампиньоновые, Агариковые - Agaricaceae .

13. Остатки общего покрывала длительно сохраняются в виде вольвы у основания ножки. Споровый порошок белый или розовый. Роды Поплавки, Толкачики - Amanitopsis , Вольвариелла - Volvariella из сем. Мухоморовые, Аманитовые - Amanitaceae .

Вольва отсутствует…........................................................................................14

14. Споровый порошок белый. Сем. Гигрофоровые - Hygrophoraceae .

Приложение 5

Правила чтения латинских названий

Латинский язык является языком международной научной терминологии
и номенклатуры. Его широко используют в биологии, медицине, фармакологии, геологии и других науках.

Студенты-биологи педагогических специальностей должны правильно читать и произносить латинские названия низших растений и прокариот, которые встречаются в специальной литературе, учебниках школьного курса.

Для правильного произношения латинских названий, необходимо знать латинский алфавит, правила чтения и произношения, которые приводятся ниже.

Начертание буквы	Название	Произношение буквы
		[ц] или [к] [г] (мягкое)

26 звуков - 7 гласных (а, е, i, j, o, u, y) и 19 согласных (b, c, f, g, h, l, m, n, p, g, r, s, t, v, w, x, z).

Особенности произношения некоторых звуков в латинском языке
при сочетании их с другими звуками

Гласный Ее произносится как [э ]:

Zygnema - зигнэма (зигнема - водоросль);

Euglena - эуглэна (евглена - водоросль);

Pleurotus - плэуротус (вешенка - гриб).

Гласный Ii произносится как [и ]:

Fragilaria - фрагилария (фрагилария - водоросль);

Spirogira - спирогира (спирогира - водоросль).

Jj - в начале слова перед гласными и в середине слова между двумя гласными произносится как [й ]:

Jubata - йюбата (гривистая);

Major - майор (большой).

Гласный Yy произносится как [и ], встречается только в словах греческого происхождения:

Botrydium - ботридиум (ботридиум - водоросль);

Zygnema - зигнэма (зигнема - водоросль).

Согласный Сс перед e , i , y , ae , oe произносится как [ц ]:

Scenedesmus - сцэнэдэсмус (сценедесмус - водоросль);

Oscillatoria - осциллатория (осциллатория - цианея);

Cymbella - цимбэлла (цимбелла - водоросль).

перед гласными a , o , u , перед согласными, а также в конце слова как [к ]:

Caulerpa - каулерпа (каулерпа - водоросль);

Collema - коллэма (коллема - лишайник);

Phacus - факус (факус - водоросль);

Cladophora - кладофора (кладофора - водоросль);

Nostoc - носток (носток - водоросль).

Согласный Hh произносится мягко как щелевой [г ]:

Heterococсous - гэтэрококоус (гетерококоус - водоросль);

Hydnum - гиднум (гиднум - гриб).

Согласный Kk употребляется редко, так как звук [к ] передается обычно буквой [с ]:

Kordyana - кордиана (кордиана - гриб);

Klebsiella - клэбсиэлла (клебсиелла - род бактерий).

Согласный Ll произносится мягко как [ль ]:

Volvox - вольвокс (вольвокс - водоросль);

Olpidium - ольпидиум (ольпидиум - гриб).

Согласный Ss обычно произносится как [с ]; если же он находится между двумя гласными или между гласными и согласным m , то произносится как [з ]:

Spirogira - спирогира (спирогира - водоросль);

Melosira - мэлозира (мелозира - водоросль);

Mycoplasma - микоплазма (микоплазма - гриб).

В латинском языке часто встречаются дифтонги - сочетания двух гласных звуков, произносятся как один слог:

ae - как [э ]; Anabaena - анабэна (анабена - водоросль);

oe - как [о ]; Oedogonium - одогониум (эдогониум - водоросль);

au - как [ау ]; Auricularia - аурикулария (аурикулярия - гриб);

е y - как [эу ]; Peyssonnelia - пэуссоннэла (пуссоннелия - водоросль).

Буква Qq пишется всегда с u; это сочетание произносится как [кв ]. После него всегда следует гласный звук:

Guercina - квэрцина (дубовая).

Сочетание ti перед гласным произносится как [ци ], перед согласными как [ти ]:

Mougeotia - мужоция (мужоция - водоросль);

Ustilago - устилаго (головня - гриб).

Сочетание sch читается как [сх ], а не как [ш], в латинском языке шипящих звуков нет:

Schyzophyllum - схизофилум (щелелистник - гриб);

Schizotrix - схизотрикс (схизотрикс - бактерия).

Сочетание ех перед гласной читается, как [экз ], перед согласными - как [экс ]:

Exemplum - экзэмплум (пример);

Externus - экстэрнус (наружный).

Сочетание ch произносится как [х ]:

Chara - хара (хара - водорсль);

Chondrostereum - хондростэрэум (хондростереум - гриб).

ph как [ф ]:

Phaeophyta - фаэофита (бурые водоросли);

Phellinus - фэллинус (ложный трутовик - гриб).

th как[т ]:

Thelephora - тэлэофора (телеофора - гриб);

Thiotrix - тиотрикс (тиотрикс - бактерия).

rh как [р ]:

Rhizopus - ризопус (ризопус - гриб);

Rhodophyta - родофита (красные водоросли).

Латинская буква х читается как [кс ]:

Ulotrix - улотрикс (улотрикс - водоросль);

Xanthoria - ксантория (золотянка - лишайник).

При чтении латинских названий важно соблюдать правило ударения, оно не падает на последний слог. Ударение падает на второй слог с конца, если слог долгий. Если краткий, то ударение перейдет на третий с конца слог. Некоторые слова греческого происхождения, оканчивающиеся на - ia , сохраняют греческое ударение вопреки правилам латинского языка, например, гетеростилия.

Учебное издание

Сулига Евгения Михайловна,

Иванов Дмитрий Викторович.

Низшие растения и прокариоты

(водоросли, грибы, бактерии)

Учебно-методическое пособие
для студентов биологических факультетов
специальности 011600 «Биология»

Редактор М. Б. Иванова

Корректор Н. Н. Дробышева

Подписано в печать 28.09.09. Формат 60×84/16.

Уч.-изд. л. 3,65. Усл.-печ. л. 4,5.

Тираж 100 экз. Заказ №

Издательство «Николаев»,

г. Балашов, Саратовская обл., а/я 55.

Отпечатано с оригинал-макета,

изготовленного издательской группой
Балашовского института (филиала)

Саратовского государственного университета

им. Н. Г. Чернышевского.

412300, г. Балашов, Саратовская обл., ул. К. Маркса, 29.

Печатное агентство «Арья»,

ИП «Николаев», Лиц. ПЛД № 68-52.

5я73 ... 591 ББК ...

Бюллетень новых поступлений 2004 год (10)

Бюллетень

Неизвестный ББК и/или УДК ... 89502-460-2 ББК 28 .8я73 + 28 .9я73 А1: ... 84 p. ISBN 0-582 -33786-0 ББК 81.43Англ-2-9 ЧЗ2 ... 00227-3 ББК 81.001 .2 + 81.001 .3 ЧЗ2: ... ББК 88.3я73 + 88.4я73 + 88.5я73 ... 591 с.: 8 л. ил. - (Философия. Религия. Культура) ISBN 5-699-01627-9 ББК ...

Под лупой можно рассматривать части растений непосредственно, без всякой обработки.Чтобы рассмотреть что-либо под микроскопом, нужно приготовить микропрепарат. Объект помещают на предметное стекло. Для лучшей видимости и сохранности его кладут в каплю воды и покрывают сверху очень тонким покровным стеклом. Такой препарат называют временным, после работы его можно смыть со стекла. Но можно сделать и постоянный препарат, который будет служить многие годы. Тогда объект заключают не в воду, а в специальное прозрачное смолистое вещество, которое быстро затвердевает, прочно склеивая предметное и покровное стёкла. Существуют разнообразные красители, с помощью которых окрашивают препараты. Так получают постоянные окрашенные препараты.

Что делаем. Приготовьте микроскоп к работе, настройте свет. Предметное и покровное стёкла протрите салфеткой. Пипеткой капните каплю слабого раствора йода на предметное стекло (1).

Что делать. Возьмите луковицу. Разрежьте её вдоль и снимите наружные чешуи. С мясистой чешуи оторвите иголкой кусочек поверхностной плёнки пинцетом. Положите его в каплю воды на предметном стекле (2).

Осторожно расправьте кожицу препаровальной иглой (3).

Что делать. Накройте покровным стеклом (4).

Временный микропрепарат кожицы лука готов (5).

Что делаем. Приготовленный микропрепарат начните рассматривать при увеличении в 56 раз (объектив х8, окуляр х7). Осторожно передвигая предметное стекло по предметному столику, найдите такое место на препарате, где лучше всего видны клетки.Что наблюдаем. На микропрепарате видны продолговатые клетки, плотно прилегающие одна к другой (6).

Что делаем. Можно рассмотреть клетки на микроскопе при увеличении в 300 раз (объектив х20, окуляр х15).

Что наблюдаем. При большом увеличении (7) можно рассмотреть плотную прозрачную оболочку с более тонкими участками — порами. Внутри клетки находится бесцветное вязкое вещество — цитоплазма (окрашена йодом).

В цитоплазме находится небольшое плотное ядро, в котором находится ядрышко. Почти во всех клетках, особенно в старых, хорошо заметны полости — вакуоли.

Вывод: живой растительный организм состоит из клеток. Содержимое клетки представлено полужидкой прозрачной цитоплазмой, в которой находятся более плотное ядро с ядрышком. Клеточная оболочка прозрачная, плотная, упругая, не даёт цитоплазме растекаться, придаёт ей определённую форму. Некоторые участки оболочки более тонкие — это поры, через них происходит связь между клетками.Таким образом, клетка — это единица строения растения.

Министерство образования и науки РФ

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Шадринский государственный педагогический институт»

Кафедра естественнонаучных дисциплин с методикой преподавания

Способы приготовления микропрепаратов по биологии

Курсовая работа

по специальности 050102 «Биология»

Исполнитель:

Горшкова Екатерина Андреевна

Студентка 3 курса дневного отделения

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук, доцент

Шарыпова Надежда Владимировна

_________________________________

Оценка __________________________

Шадринск

2014

Введение ………………………………………………………………………….3

§ 1. Характеристика микропрепаратов и их использование ………………….4

§ 2. Оборудование, необходимое для приготовления микропрепаратов …….7

§ 3. Подготовка материала для приготовления микропрепаратов …………...12

§ 4. Способы приготовления микропрепаратов ……………………………….17

Заключение ………………………………………………………………………31

Библиографический список …………………………………………………….32

Приложение ……………………………………………………………………...34

Введение

Актуальность темы исследования . Микропрепараты являются наглядным средством обучения и поэтому их широко используют на уроках биологии во время лабораторных занятий, при изучении нового материала, обобщениях, сопоставлениях и опросе.

В связи с недостаточным обеспечением кабинетов биологии готовыми микропрепаратами, которые необходимы для лучшего изучения предмета, их можно изготовить самостоятельно.

Исходя из актуальности, мы выбрали следующую тему исследования: «Способы приготовления микропрепаратов по биологии».

Объектом исследования являются микропрепараты.

Предмет – способы приготовления микропрепаратов.

Цель исследования : изучить виды микропрепаратов по биологии и способы их приготовления.

Задачи исследования:

1. Изучить и проанализировать литературу по данной теме.
2. Дать характеристику микропрепаратов и советы по их использованию на уроках биологии.
3. Описать оборудование, необходимое для приготовления микропрепаратов.
4. Научиться подготавливать материал для приготовления микропрепаратов.
5. Изучить способы приготовления микропрепаратов.

Для реализации целей и задач использовали следующие методы исследования: анализ научно-методической литературы по теме исследования, опытно-поисковая работа и обобщение ее результатов.

Структура курсовой работы . Курсовая работа состоит из введения, 4 параграфов и заключения, представлен библиографический список, включающий 16 источников, 1 приложения.

§ 1. Характеристика микропрепаратов и их использование

К натуральным препарированным пособиям относятся гербарии, влажные препараты, микропрепараты.

Микропрепарат, представляет собой тонкий срез органа живого организма или микрочастицу, заключенный в прозрачный бальзам (иммерсионное масло) или высушенный, помещенный между двумя стеклами (предметным и покровным) .

Происхождение микропрепаратов берет начало в использовании слоновой кости или обычной кости в качестве подставки под образцы, которые помещались между дисками прозрачной слюды. Подобная конструкция была популярной в викторианской Англии, пока Королевское Микроскопическое Общество не представило стандартизированное предметное стекло для микроскопа .

Микропрепараты позволяют демонстрировать внутреннее клеточное строение организмов, что помогает формированию у учащихся знаний о едином клеточном строении организмов. Микропрепараты можно разделить на две группы:

• постоянные, изготовленные фабричным путем специально для обучения;
• временные, приготовленные учителем для урока или на уроке самими школьниками однократного пользования.

Постоянные микропрепараты представляют собой тончайшие срезы тканей организмов, их органов. Клетки в большинстве своем не имеют окраски и потому, даже при большом увеличении микроскопа, бывает трудно рассмотреть внутриклеточные структуры, в том числе ядро. В связи с этим клеточные микропрепараты окрашивают специальными красителями для придания им большей наглядности. Учителям обязательно надо предупреждать детей о том, что цвет не является естественным для микроструктур. Используют их при изучении нового материала, обобщениях, сопоставлениях и опросе.

Временные препараты так называются потому, что не сохраняются долго. После ознакомления с микрообъектом временный препарат смывается с предметного стекла. Приготовление микропрепарата - один из обязательных видов умений, формируемых в курсе биологии, начиная с 6 класса .

Для изучения живых клеток микроорганизмов применяют препараты “раздавленная капля”, “висячая капля”, “отпечаток”, “агаровая пленка” (“микрокультура”). Препараты живых клеток рассматривают с “сухими системами ” микроскопа. Препараты, работа с которыми уже закончена, прежде чем вымыть, выдерживают в дезинфицирующем растворе .

Микропрепараты позволяют проводить широкий ряд опытов, предусмотренных программой школьного курса биологии. Они предназначены для детального изучения микроскопических структур под микроскопом.

Преподаватель до работы с микропрепаратом должен четко объяснить учащимся, что они должны увидеть, используя таблицы, рисунки, схемы и т. п.

Во время опроса преподаватели нередко используют «немые», (без этикеток) микропрепараты. Учащимся дается задание определить микропрепараты, рассказать о строении той или иной ткани. Целесообразно хранить одинаковые микропрепараты в одной упаковке, чтобы можно было быстро раздать их учащимся.

Микропрепараты хранят вдали от отопительных приборов и так, чтобы предметное стекло находилось в горизонтальном положении для предотвращения «сползания» микропрепарата .

Требования к микропрепаратам:

1. Стекла должны быть бесцветными и прозрачными. Покровное стекло должно быть тоньше предметного, которое служит основой изделия.
2. Микропрепарат должен быть центрирован, т.е. расположен в середине покровного стекла. Местоположение очень мелкого объекта должно быть отмечено рамкой.
3. Микроскопические срезы должны быть очень тонкими и иметь все необходимые для изучения элементы.
4. Отдельные ткани микропрепарата должны быть окрашены ярким стойким красителем.
5. Микропрепараты должны выпускаться в виде набора для каждого раздела курса биологии. Количество одноименных препаратов в наборе должно быть достаточным для проведения лабораторной работы всеми обучающимися в классе (15-20 шт.).
6. К набору микропрепаратов должны быть приложены методические рекомендации, где должны быть приведены рисунки изучаемых микрообъектов и задания для самостоятельной работы учащихся .

Изучение микропрепаратов в процессе обучения приобщает к методам науки, дает возможность путем непосредственного наблюдения увидеть строение организмов, их частей.

Микропрепараты представляют собой микроскопически малые живые объекты, тончайшие срезы их органов и частей. Эти объекты заключены между покровным и предметным стеклами в специальном растворе. Для лучшей различимости препараты окрашивают, поэтому окраска объектов искусственная.

1. Да начала работы с микропрепаратом требуется записать его название, тему лабораторного занятия.

2. Изучение любого микропрепарата начинают с рассматривания под микроскопом при малом увеличении (56х). Затем выбирают место, где детали лучше видны, и ставят большое увеличение (120-300х) и приступают к зарисовке. При зарисовке микропрепарата надо соблюдать соотношение размерах отдельных частей оригинала. Зарисовка помогает лучше запомнить и создать зрительное представление об объекте.

3. Сначала на рисунке обозначают основные элементы, затем дополняют деталями. Под рисунком подписывают название микропрепарата и увеличение, при котором выполнен рисунок. На одной странице ученической тетради делают 2-3 рисунка. Основные структуры микропрепарата обозначают указателями и напротив каждой пишут цифру с последующей их расшифровкой. Контур поля зрения микроскопа не обозначают .

Таким образом, существует 2 вида микропрепаратов – временные и постоянные. Их отличие состоит во времени хранения и способах приготовления. Микропрепараты должны отвечать определенным требованиям, которые необходимо тщательно соблюдать. Для приготовления микропрепаратов необходимо специальное оборудование, которое описано в следующем параграфе.

§ 2. Оборудование, необходимое для приготовления микропрепаратов

Рабочий стол.

При отсутствии специального стола с успехом может быть приспособлен любой стол (желательно с ящиками) с площадью рабочей поверхности не менее 60*120см.

Если крышка стола не имеет специального покрытия, то его следует сделать из какого-либо влагоустойчивого материала. Однако участок стола, предназначенный для непосредственной работы по приготовлению препаратов, в любом случае необходимо накрыть стеклом и расположить под ним небольшие (9*12см) листы белой или черной бумаги. Этим создается соответствующий фон, облегчающий работу с окрашенными (белый лист) и не окрашенными (черный лист) объектами. Рекомендуется также на оба листа нанести контуры предметного стекла с обозначением места расположения и размеров покровного стекла.

Для того, что бы удобнее расположить необходимое оборудование, следует иметь двухъярусную полку для реактивов, растворов и посуды, которая устанавливается либо перед работающим (вдоль заднего края стола), либо сбоку в зависимости от расположения стола относительно источника света.

Лабораторная посуда.

Широкогорлые банки с притертыми пробками различной вместимости от 50 до 200 мл – используют для составления гистологических батарей, предназначенных для подготовки кусочков тканей к заливке различными средами. Более крупные банки применяют для фиксации и хранения кусочков тканей в фиксирующих жидкостях, обработки предметных стекол, приготовление нейтрального формалина и пр.

В место банок с притертыми пробками можно использовать небольшие хозяйственные банки с жестяными завинчивающимися крышками, разного объема.

Бюксы — небольшие круглые стеклянные стаканчики различного диаметра и высоты с шлифованными крышками.

Биологические стаканчики — круглые, овальные или четырехугольные (как и высокие бюксы) применяют для проводки гистологических срезов, монтированных на предметных стеклах. Для придания устойчивости и обеспечения порядка в расстановке их помещают в специальные стойки, изготовленные из дерева или пластмассы, по несколько штук в ряд в зависимости от методики обработки.

Чашки Петри — широкие, плоские стеклянные чашки с крышками – пригодны для различных манипуляций (окраска свободно плавающих и наклеенных на предметные стекла срезов, использование в качестве подставок под бюксы и т.д.).

Мерная посуда – цилиндры и мензурки различной емкости (от 10 до 250-500 мл) воронки различных размеров.

Химические стаканчики — круглые стеклянные стаканчики без крышек вместимостью 50-100 мл – находят широкое применение при проведении гистохимических реакций, окраски срезов наклеенных на стекла и т.д.

Колбы (плоскодонные) – вместимостью от 50 мл до 2 л. Малые колбы применяют для приготовления и хранения растворов различных красителей, большие — под дистиллированную воду и прочие жидкости, расходуемые в больших количествах.

Пипетки обычные (предназначенные для закапывания лекарств) используют для накапывания на срезы красителей и различных жидкостей, градуированные (вместимостью 0,1-100 мл) применяют для отмеривания малых количеств различных жидкостей. Можно использовать в настоящее время широко используемые автоматические пипетки различной вместительности.

Предметные стекла – прямоугольные пластины размером 76*25 мм толщиной 1,2-1,4 мм, предназначенные для размещения срезов в процессе приготовления микропрепаратов . Более толстые стекла не позволяют получить резкое изображение краев диафрагмы осветителя в плоскости препарата, так как оно оказывается в толще стекла, а это нарушает фокусировку конденсора и резко снижает четкость изображения .

Покровные стекла – представляют собой тонкие (0,15-0,17 мм толщины, более толстые стекла ухудшают качество изображения) пластинки различных размеров. Служат для покрытия обработанных срезов, расположенных на предметных стеклах. Размеры покровных стекол выбирают в зависимости от площади объекта.

Инструменты.

Инструменты, используемые в гистологической лаборатории, включают в себя пинцеты, скальпели, кровоостанавливающие зажимы, корнцанг, бактериологические петли шпатели, препаровальные иглы – прямые и изогнутые, металлические и стеклянные. Стеклянные иглы необходимы при импрегнации серебром, когда металлические иглами пользоваться нельзя.

Так же необходимо иметь спиртовку, волосяную кисточку для снятия срезов с микротомного ножа, фильтровальную бумагу, иголки, нитки, плотную бумагу для этикетирования материала, лейкопластырь и карандаш по стеклу .

Подготовка предметных стекол.

Предметные стекла, применяемые для получения гистологических препаратов, необходимо предварительно подготовить. Исключение составляют готовые к использованию и специально упакованные импортные предметные стекла.

Предметные стекла моют в теплой мыльной воде или кипятят 15 минут в 2-3 % растворе гидрокарбоната натрия, затем ополаскивают горячей водой и промывают в течение нескольких часов в проточной воде. Вымытые стекла протирают чистой хлопчатобумажной тканью и на несколько дней помещают в 96 % спирт. Обезжиренные стекла извлекают пинцетом из этой смеси, протирают чистой тканью и складывают в коробочку.

Предметные стекла также хорошо обезжириваются в крепком растворе соляной кислоты. Через несколько суток их промывают проточной водой и высушивают.

Качество обезжиривания можно проверить, капнув на предметное стекло воду из пипетки: по обезжиренному стеклу вода растекается тонким слоем, а не собирается в каплю.

Для лучшей фиксации срезов на стекле его предварительно смазывают смесью белка с глицерином. Свежий яичный белок взбивают и фильтруют через крупнопористый фильтр, смоченный дистиллированной водой, затем размешивают с равным объемом глицерина и добавляют несколько кристаллов тимола. Смесь хранится в течение нескольких месяцев. Применяют также смесь, в состав которой входят 15 мл сыворотки крови, 5 мл дистиллированной воды и 6 мл 5 %-ного формалина. После фильтрации смесь готова к нанесению на предметные стекла. Ее использование дает лучшие результаты, чем применение яичного белка, так как при окрашивании не образуется фон.

Для нанесения белка на обезжиренные предметные стекла в одну руку берут 5-6 стекол в виде веера, а в другую — чистую стеклянную палочку, которой наносят белок, прикасаясь к каждому стеклу. Затем белок растирают обезжиренным спиртом пальцем по поверхности стекла до его середины, прилагая небольшое усилие. Некоторые авторы рекомендуют натертые белком стекла прогревать в термостате, но опыт показывает, что это излишне, так как после переноса срезов на стекла их помещают в термостат или на специальный столик для просушивания, где одновременно происходит коагуляция белка.

Разработан способ фиксации среза к предметному стеклу без предварительного натирания последнего белком с глицерином.

В ванночку с теплой дистиллированной водой капают несколько капель жидкого казеинового клея и перемешивают. В полученную мутноватую жидкость опускают срезы, расправляют препаровальной иглой и вылавливают на чистое обезжиренное стекло.

Этот способ дает неизменно хороший эффект и вокруг среза отсутствует окрашенный фон, как это часто бывает при применении белка .

Таким образом, для приготовления микропрепаратов требуется специальное оборудование и инструменты. Основными из них являются предметное и покровное стекла. Прежде чем начать готовить микропрепарат, необходимо правильно подготовить предметные стекла. К их хранению также предъявляются специальные требования. Но подготовки одного оборудования не достаточно для приготовления микропрепаратов, необходимо также подготовить материалы для исследования. Подробно об этом говорится в следующем параграфе.

§ 3. Подготовка материала для приготовления микропрепаратов

Микропрепараты делятся на временные и постоянные. Подготовка материала для временных препаратов включает фиксацию и окраску.

Фиксация – это процесс быстрой консервации клеточных структур, при котором все физиолого-биохимические процессы останавливаются, а водорастворимые вещества переходят в нерастворимое состояние. Следовательно, фиксация позволяет сохранить внутриклеточные структуры в неизменном виде на длительное время. Однако при фиксации в клетках могут появляться артефакты – новые структуры, которые отсутствуют в живой клетке, например, разнообразные вакуоли. Для предотвращения появления артефактов необходимо использовать специально подобранные химические растворы – фиксаторы, а сама фиксация должна проводиться в определенных условиях. В частности, желательно использовать охлажденные фиксаторы (до 2-3 градусов); для фиксации нужно брать отдельные клетки или кусочки тканей не толще 5мм; объем фиксатора должен превышать объем фиксируемого материала в 50-100 раз; фиксатор не должен использоваться для длительного хранения материала; фиксатор не должен использоваться повторно.

Рассмотрим состав и применение наиболее широко распространенных фиксаторов.

Формалин (формальдегид, или муравьиный альдегид). Наиболее простой и широко распространенный фиксатор. Применяется в виде водных растворов с концентрацией 4-10 %, при этом за 100 % принимается концентрация продажного формалина. Продажный формалин содержит примесь муравьиной кислоты, которую нейтрализуют с помощью углекислого кальция в течение 24 часов. Время фиксации от 1 часа до 24 часов. Для длительного хранения материал переносят в свежий 10 %-ный формалин. Чистый формалин используют в том случае, если планируется дальнейшее изучение локализации и активности ферментов. Чаще же формалин включается в рецептуру более сложных фиксаторов.

Спиртовые фиксаторы. Содержат этиловый или метиловый спирт. Водные растворы спиртов в чистом виде (70 %, 96 % или 100 %) используются относительно редко. Чаще применяют 100 %-ные спирты, которые смешивают с другими веществами. Нужно иметь в виду, что метиловый спирт (метанол) и его пары – ядовиты.

В качестве универсальных фиксаторов используют различные композиции на основе формалина, спиртов, органических кислот и неорганических веществ.

Уксусный алкоголь (ацеталкоголь). Это один из наиболее простых фиксаторов. Состоит из 3 частей абсолютного спирта (этилового, а лучше – метилового) и 1 части ледяной уксусной кислоты. Для приготовления 100 %-ного (абсолютного) спирта исходные спирты обезвоживают. Для обезвоживания этилового спирта (этанола) используют безводный сульфат меди, а для обезвоживания метилового спирта (метанола) – используют оксид кальция. Хранят их в герметичной посуде. Нужно иметь в виду, что все абсолютные спирты особенно ядовиты. Для приготовления ледяной уксусной кислоты исходную концентрированную кислоту охлаждают в холодильнике; при этом кислота замерзает, раньше, чем вода. Жидкость сливают, а замерзшую кислоту оттаивают и используют для приготовления фиксатора. Фиксатор готов для употребления через 24 часа. Хранить фиксатор в темном холодном месте. Время фиксации – 2...24 часа. Затем материал переносят в свежий фиксатор, в котором он может храниться до 1 месяца в холодильнике. Для более длительного хранения материал переносят в 70 %-ный спирт .

Фиксатор Карнуа. Состав – абсолютный спирт – 10 см 3 ; хлороформ – 3 см 3 ; уксусная кислота – 1 см 3 . Срок фиксации 1-3 часа .

Фиксаторы, содержащие пикриновую кислоту, например, смесь Буэна – 15 мл насыщенного водного раствора пикриновой кислоты: 5 частей формалина: 1 часть ледяной уксусной кислоты. Этот фиксатор готовят непосредственно перед употреблением. Время фиксации от 1 до 24 часов (иногда несколько суток). Фиксированный материал хранят в 70 %-ном спирте.

Фиксаторы, содержащие сулему (хлорид ртути (II) – HgCl 2 ). Сулема используется в виде насыщенного водного раствора в смеси с ледяной уксусной кислотой (25:1), формалином (8,5:1) и более сложных композиций (фиксатор «Суза», фиксатор Ценкера и др.). Время фиксации от 1 до 24 часов. Затем сулему удаляют спиртовым раствором йода (6 частей 70 %-ного спирта:1 часть йодной настойки), а йод удаляют 70 %-ным спиртом. Фиксированный материал хранят в 70 %-ном спирте.

Фиксаторы, содержащие осмий (четырехокись осмия, или осмиевая кислота). Дают наилучшие результаты, используются при изготовлении препаратов, как для световой, так и электронной микроскопии. Можно использовать 1-2%-ный раствор осмиевой кислоты, но чаще применяют композиции, например, фиксатор Флеминга – 15 частей 2 %-ной осмиевой кислоты: 1 часть ледяной уксусной кислоты. Фиксация протекает медленно (от 24 часов до нескольких суток).

Кроме перечисленных фиксаторов общего назначения, существуют и специальные фиксаторы. Например, фиксатор для митохондрий содержит 4 части 3 %-ного раствора дихромата калия и 1 часть 40 %-ного формалина. Фиксатор для хлоропластов содержит 15 частей насыщенного раствора медного купороса, 1 часть 40 %-ного формалина и 5 частей воды.

В ряде случаев вместо химической фиксации применяется быстрое замораживание образцов, например, при температуре жидкого азота (–196 0 ) или при температуре сухого льда (–78 0 ). Замороженные объекты могут быть обезвожены путем возгонки воды в вакууме при температуре ниже –40 0 (этот процесс называется лиофилизация).

Окрашивание позволяет выявлять внутриклеточные структуры, обладающие повышенным сродством к определенным красителям. Красители – это относительно низкомолекулярные органические вещества, обладающие повышенным сродством к определенным химическим компонентам клетки.

Существует множество красителей, которые используются для различных целей. Нужно иметь в виду, что выбор красителя связан с характером фиксации и различными методами предварительной обработки клеток.

Названия красителей могут соответствовать получаемой окраске (рубин, кармин, метиловый синий, метиленовый синий, генциановый фиолетовый, метиловый зеленый, оранжевый золотой). Иногда русские названия цветов заменяют на немецкие, например: метилблау, генцианвиолет. В других случаях названия носят отвлеченный, исторически сложившийся характер, например: пиронин, фуксин, сафранин, флороглюцин, судан III. Иногда название красителя не соответствует полученной окраске, например, синий тионин дает фиолетово-красное окрашивание. Довольно редко применяются химические номенклатурные названия красителей, например: диметиламинобензальдегид, 8-амино-1-нафтол-5-сульфокислота.

Различают основные (щелочные), кислотные и нейтральные красители. Основные красители избирательно окрашивают базофильные клеточные структуры (то есть структуры с кислотными свойствами). Кислотные красители избирательно окрашивают ацидофильные, или оксифильные клеточные структуры (то есть структуры со щелочными свойствами). Нейтральные красители окрашивают и базофильные, и ацидофильные структуры.

Наименее токсичные красители используются для прижизненной окраски клеток. Эти красители обычно применяют в виде водных растворов, например: метиленовый синий (концентрация от 1:1000 до 1:10000), трипановый синий (0,5 %-ный раствор), нейтральный красный (от 1:50000 до 1:200000).

Красители для фиксированных клеток могут использоваться в чистом виде (водные или спиртовые растворы, концентрация от 0,1 % до 1 %), например: эозин, фуксин. Часто используют смеси красителей, например, смесь Романовского–Гимза (содержит метилен–азур, метиленовый фиолетовый, метиленовый синий и эозин), окраска по Маллори (последовательное использование кислотного фуксина S, а затем смеси анилинового синего и оранжевого золотого G), азур–эозин, метилблау–эозин.

Однако чаще краситель образуется в ходе его приготовления. Например, широко известное вещество растительного происхождения гематоксилин становится красителем только после его окисления до гематеина. Для окрашивания ядер и хромосом широко используются красители в сочетании с органическими кислотами. Рассмотрим методики приготовления некоторых наиболее простых красителей.

Приготовление 2 %-ного ацетофуксина. 1 грамм основного фуксина растворяют в 50 мл 40 %-ной уксусной кислоты при подогревании на водяной бане.

Приготовление 1 %-ного ацеторсеина. К 1 грамму орсеина добавляют 50 мл ледяной уксусной кислоты и настаивают около 12 часов. Затем смесь нагревают до кипения и добавляют 50 мл дистиллированной воды. Затем нагревают до кипения и охлаждают, повторяя эту процедуру 10 раз. Через сутки краситель фильтруют. Перед окрашиванием на 9 частей красителя добавляют 1 часть 1 н. HCl.

Приготовление 4 %-ного ацетокармина. Раствор готовят в термостойкой колбе с водяным холодильником. 4 грамма ацетокармина смешивают с 100 мл 50 %-ной уксусной кислоты, и кипятят 1 час. Через сутки краситель фильтруют. Аналогичным образом приготавливается ацетолакмоид.

Вместо уксусной кислоты часто используют другие органические кислоты, например, 40 %-ную молочную кислоту.

Все красители после приготовления фильтруют и хранят в темном прохладном месте. Время окрашивания препаратов зависит от температуры (обычно от 20 минут до 1 суток). При нагревании или кипячении время окрашивания сокращается.

Кроме окрашивания органическими красителями отдельные структуры можно выделить, используя их импрегнацию серебром и другими металлами .

Таким образом, при приготовлении некоторых временных микропрепаратов необходима фиксация и окраска исследуемого материала. Благодаря этому можно лучше рассмотреть объект под микроскопом. Конкретно о способах приготовления микропрепаратов мы расскажем в четвертом параграфе.

§ 4. Способы приготовления микропрепаратов

При изготовлении временных микропрепаратов необходимо соблюдать следующую последовательность операций:

1. Вымыть и тщательно вытереть предметное и покровное стекла. Чтобы не сломать очень хрупкое покровное стекло, надо поместить его в складку салфетки между большим и указательным пальцами правой руки и осторожно вытереть его круговыми движениями пальцев.

2. Нанести на предметное стекло пипеткой каплю жидкости (воды, глицерина, раствора, реактива или красителя).

3. Сделать срез изучаемого органа при помощи лезвия. Лезвие должно быть очень острым.

4. Выбрать самый тонкий срез, перенести его с помощью препаровальной иглы или тонкой кисточки в центр предметного стекла в каплю жидкости.

5. Закрыть срез покровным стеклом так, чтобы под него не попал воздух. Для этого покровное стекло взять двумя пальцами за грани и подвести под углом нижнюю грань к краю капли жидкости и плавно его опустить.

6. Если жидкости много, и она вытекает из-под покровного стекла, удалить ее при помощи фильтровальной бумаги. Если же под покровным стеклом остались места, заполненные воздухом, то добавить жидкость, поместив ее каплю рядом с краем покровного стекла, а с противоположной стороны фильтровальную бумагу .

Перед учителями биологии и руководителями кружков рано или поздно встает задача изготовить учебный микропрепарат. Какое же вещество, способное надолго зафиксировать биологический объект, и как сделать эту процедуру простой и доступной. Известные бальзамы (смолы-фиксаторы) никогда не относились к легкодоступным веществам, особенно в удалении от крупных городов. Кроме того, говорят, что вещества эти не безвредны. И, наконец, сам процесс их использования довольно непрост.

Для изготовления препарата можно использовать клей ПВА. Важно, чтобы препарат был влажный, хорошо смоченный, а клей – свежий и чуть разбавленный чистой холодной кипяченой водой до нужной концентрации (клей представляет собою эмульсию и легко разводится). После нескольких проб и ошибок нужную концентрацию получится составлять и определять без труда.

Затем, на чистое предметное стекло наносят каплю воды – кипяченой или дистиллированной. Воду надо аккуратно удалить чистой, не оставляющей волосков тканью или фильтровальной бумагой так, чтобы стекло было чуть влажным. Это, как и влажность образца, способствует равномерному (без пузырьков) смачиванию. На подготовленную поверхность нужно нанести небольшую каплю заранее приготовленного клея ПВА так, чтобы не появились пузырьки воздуха. Они иногда и не мешают, но внешний вид препарата портят. В эту каплю аккуратно переносят заранее подготовленный срез или образец, например, предварительно умерщвленную горячей водой дафнию. Затем плавным наклонным движением надо сверху положить покровное стекло, также чистое и слегка влажное. Слой клея между стеклами должен быть как можно более тонким.

Если что-то не удалось, а образец ценный и достаточно крупный, почти всегда, в отличие от смол, есть возможность его отмыть простой водой и процедуру повторить. Излишки клея аккуратно смываются тонкой струйкой воды; нужно следить, чтобы она не затекала между стеклами. Покровное стекло необходимо придерживать. Чуть мутноватые остатки воды можно аккуратно удалить фильтровальной бумагой или полоской тонкой ткани без ворса.

Готовые препараты надо разложить в теплом сухом месте. Индикатором готовности препарата служит его прозрачность. В зависимости от очень многих факторов высыхание до прозрачного состояния продолжается от одной до четырех недель. Бывает, что слишком толстый слой клея или клей, загрязненный примесями, полностью прозрачным не становится – это несколько ухудшает изображение, но благодаря небольшой глубине резкости микроскопа даже такие препараты доступны для изучения.

Нет гарантии, что этот метод можно применять для изготовления любых препаратов, поскольку некоторые из них требуют окрашивания, а красители могут взаимодействовать с клеем .

Т.Н. Лашкина, учитель биологии и экологии средней школы № 23, из г. Сызрань предлагает следующий способ приготовления микропрепаратов. Можно взять обыкновенный желатин, залить его водой для набухания. Затем в столовую ложку набрать немного набухшего желатина (без воды) и нагреть над огнем. Когда желатин разойдется (не надо, чтобы он закипал), капнуть его на предметное стекло. В эту каплю положить образец и закрыть покровным стеклом, хорошо придавить пальцем его для равномерного распределения желатина. Микропрепарат готов.

Вместо покровного стекла можно использовать целлофан, если нет покровных стекол. Кроме того, целлофан имеет одно преимущество: микропрепарат нельзя раздавить, т.к. целлофан эластичен и не трескается, как покровное стекло.

С желатином надо работать быстро, иначе он застывает. Но если такое случится, то достаточно подержать стекло над огнем – и желатин вновь станет жидким. Желатин безвреден, доступен и очень экономичен .

Приготовление срезов растений

Для изготовления срезов объект берут большим и указательным пальцами левой руки и при помощи скальпеля или ножа выравнивают его поверхность. В правую руку берут лезвие или бритву и делают им плавное быстрое движение по объекту к себе и вправо (см. приложение рис. 1, А). Срезы должны быть небольшие и тонкие. Их снимают с лезвия мягкой кисточкой и переносят на предметное стекло в каплю среды (см. приложение рис. 1, Б).

Для изготовления срезов мелких объектов последние помещают в сердцевину бузины (см. приложение рис. 2), предварительно сделав в ней разрез или углубление, и проделывают вышеописанную операцию. Лезвие, используемое для получения срезов должно быть острым (должно легко перерезать волос) .

Микропрепараты по ботанике

Препарат среза эпидермы с нижней стороны листа традесканции виргинской в капле воды.

Для изготовления препарата лист традесканции обвернуть вокруг указательного пальца левой руки так, чтобы нижняя сторона фиолетового цвета была обращена наружу. Правой рукой при помощи препаровальной иглы надорвать эпидерму над средней жилкой в средней части листа и пинцетом снять ее кусочек. При этом невольно захватывается и часть мякоти листа (мезофилла), но обычно можно найти тонкий участок на периферии, состоящий из одного ряда клеток эпидермы. Сорванный кусочек положить на предметное стекло в каплю воды наружной стороной вверх и накрыть покровным стеклом .

Препарат клеток листа элодеи канадской.

В верхней части побега элодеи при помощи пинцета оторвите лист и перенесите в каплю воды на предметное стекло. Лист следует положить нижней стороной к предметному стеклу.

Препарат хромопластов в клетках зрелых плодов.

При помощи препаровальной иглы возьмите маленькие кусочки мякоти зрелых плодов ландыша, рябины и шиповника. Поместите каждый кусочек в каплю воды на предметное стекло и аккуратно разделите клетки. Накройте покровным стеклом.

Препарат крахмальных зерен картофеля.

Разрежьте клубень картофеля. Со свежесрезанной поверхности возьмите скальпелем небольшое количество выступившей жидкости и перенесите в каплю воды на предметное стекло, накройте покровным стеклом.

Препарат каменистых клеток околоплодника груши.

На срезе свежего или фиксированного спиртом околоплодника груши найдите группу каменистых клеток, извлеките их. Поместите на предметное стекло и раздавите кончиком скальпеля.

Нанесите на каменистые клетки каплю 1 %-ного раствора флороглюцина в 50 %-ном этаноле, затем добавьте несколько капель концентрированной соляной кислоты (при работе с концентрированной кислотой следует соблюдать правила техники безопасности).

Одревесневшие оболочки приобретут вишнево-красный или малиновый цвет.

После появления окрашивания удалите реактив фильтровальной бумагой, добавьте каплю глицерина и накройте препарат покровным стеклом .

Препарат устьиц клеток растения.

Приготавливают несколько срезов нижней эпидермы листа и помещают их на 2 часа в 5 %-ный раствор глицерина. Срезы помещают на предметное стекло в том же растворе. Рассматривают препарат.

Затем заменяют глицерин на воду, оттягивая его из-под стекла фильтровальной бумагой. Смотрят, что изменилось.

После этого воду заменяют 20%-ным раствором глицерина или 1М раствором сахарозы. Наблюдают изменения (см. приложение рис. 3) .

Приготовление микропрепаратов по зоологии

Приготовление препарата простейших организмов сенного настоя.

С помощью стеклянной палочки поместите на предметное стекло каплю раствора метилцеллюлозы.

Пипеткой капните в этот раствор сенный настой. Накройте каплю покровным стеклом. Рассмотрите под микроскопом [ 6 ] .

Приготовление микропрепаратов по физиологии человека

Препарат мазка крови для исследования лейкоцитарной формулы. Каплю крови наносят на сухое предметное стекло (см. приложение рис. 4, а). Шлифовальное стекло устанавливают под углом 45° к предметному. Кровь при соприкосновении со шлифовальным стеклом растекается по его краю (см. приложение рис. 4, б). После этого быстрым движением шлифовальное стекло продвигают вперед, скользя по поверхности предметного стекла. При этом кровь тонким равномерным слоем размазывается по предметному стеклу (см. приложение рис. 4, в).

Хорошо приготовленный мазок крови выглядит на просвет желтоватым, равномерным и прозрачным. В этом случае форменные элементы крови располагаются в нем в один слой .

Приготовление микропрепаратов по микробиологи

Приготовление препаратов мертвых клеток микроорганизмов.

Для детального изучения микроорганизмов применяют фиксированные микропрепараты. При фиксации микробов убивают и затем окрашивают.

Приготовление фиксированных препаратов складывается из следующих операций: приготовление мазка, высушивание препарата, его фиксация, окраска и просушивание.

1 этап: Техника приготовления мазков (см. приложение рис. 5).

1. Приготовление мазка с плотной питательной среды

• на обезжиренное предметное стекло наносят петлей небольшую каплю физиологического раствора;
• в правую руку берут бактериологическую петлю, в левую – пробирку с культурой;
• петлю стерилизуют, внося ее в пламя горелки в вертикальном положении (накаливание докрасна) (см. приложение рис. 5-1);
• вынимают пробку из пробирки, захватив ее мизинцем правой руки, и обжигают на спиртовке край пробирки (см. приложение рис. 5-2,3);
• петлю вносят в пробирку, охлаждают ее, прикасаясь к стенкам, после чего с поверхности среды снимают небольшое количество культуры (см. приложение рис. 5-4);
• петлю вынимают, не касаясь стенок пробирки, обжигают края пробирки над спиртовкой и закрывают пробкой (см. приложение рис. 5-5,6);
• захваченную микробную культуру вносят в каплю физиологического раствора, тщательно размешивают и равномерно распределяют по стеклу в виде овала, круга или квадрата площадью 1-1,5см 2 (см. приложение рис. 5-7);
• по окончании приготовления мазка петлю вновь стерилизуют (см. приложение рис. 5-8).

1. При изготовлении мазка из культур с жидких питательных сред на предметное стекло наносят 1-3 петли исследуемого материала и равномерно распределяют по нему; при этом использование физиологического раствора не требуется. Далее поступают как описано выше.

2 этап: Высушивание мазков.

Приготовленный мазок высушивают на воздухе, над пламенем горелки (но не в пламени), в потоке теплого воздуха или в термостате.

Необходимо знать, что нагревание может нарушить структуру микробов, а так же то, что не до конца высушенный препарат при фиксации окажется испорченным.

3 этап: Фиксация мазков.

Различают физический и химический методы. При фиксации физическим методом стекло с мазком, обращенным кверху, медленно проводят 3-4 раза через пламя. При этом микроорганизмы погибают, мазок прикрепляется к стеклу и не смывается. С недофиксированного мазка микробы смываются, в перефиксированном наблюдается деструкция микроорганизмов, то есть распад на отдельные фрагменты.

Фиксация химическим методом достигается погружением мазков в фиксирующую жидкость, которой может служить:

Спирт (15-20 мин)

Спирт-эфир (10-15 мин)

Метиловый спирт (5 мин)

Хлороформ (несколько секунд)

Охлажденный ацетон (5 мин)

4 этап: Окраска мазков.

Окраска микроорганизмов имеет большое диагностическое значение. Она представляет собой сложный физико-химический процесс, в механизме которого существенную роль играют явления адсорбции, капиллярности, химического сродства между красителями и окрашиваемым объектом, рН среды, в которой они находятся.

Различают простые (ориентировочные) и сложные (дифференциальные) методы окраски микроорганизмов.

Простая окраска.

Простая окраска бактерий выявляет только их морфологию (форму, размер и взаимное расположение микробов). Обычно употребляется только один краситель (метиленовый синий или генциановый фиолетовый). Выделяют позитивный и негативный методы окрашивания.

Позитивный:

• Приготовленный и фиксированный мазок помещают в специальный мостик над ванночкой.
• Наносят какой-либо краситель на определенное время (количество краски должно быть таким, чтобы покрыть всю поверхность мазка, достаточно нескольких капель). При этом необходимо следить, чтобы краситель на мазке не подсыхал, в случае необходимости на мазок наливают новые порции красителя.
• Затем тщательно и быстро промывают водой.
• Высушивают фильтровальной бумагой.
• Наносят каплю иммерсионного масла и микроскопируют.

Мазок считается качественным, если бактерии расположены изолированно друг от друга и равномерно окрашены.

Негативный:

При этом методе окрашивается фон мазка, а микроорганизмы остаются неокрашенными. Он применяется для исследования микроорганизмов, оболочки которых плохо воспринимают анилиновые красители (лептоспиры, спирохеты).

• На край предметного стекла наносят каплю туши и смешивают ее петлей с каплей культуры.
• Мазок делают ребром шлифованного предметного стекла аналогично приготовлению мазка крови (см. приложение рис. 6). Предметное стекло кладут на горизонтальную поверхность и придерживают левой рукой; правой рукой к капле придвигают под углом в 45 0 шлифовальное стекло, по краю которого равномерно растекается капля; сразу же, плотно прижимая шлифовальное стекло в том же положении под углом, продвигают его налево по предметному стеклу, получая равномерный мазок.
• Дают высохнуть и микроскопируют.

Дифференциальная (сложная) окраска.

Сложные, или дифференциальные способы окраски бактерий основаны на особенностях физико-химического строения микробной клетки. Позволяют, применяя несколько растворов красителей и реактивов, определить морфологические свойства и структурные компоненты клетки (споры, капсулы, жгутики и др.).

Одним из важнейших методов является окрашивание микробов по Граму. Это универсальный дифференциально-диагностический метод окраски, предложенный датским ученым Грамом в 1884г. Он используется в качестве одного из ключей в определителях микробов.

Окрашивание микробов по Граму.

Грампринадлежность микробов зависит от химического состава бактериальной клетки и строения клеточной стенки.

• На фиксированный мазок кладут небольшой кусочек фильтровальной бумаги и наливают раствор генцианвиолета на 1-2 минуты.
• Снимают бумагу, сливают краску и, не промывая водой, наливают на препарат раствор Люголя на 1 минуту (мазок чернеет).
• Обработка мазка спиртом в течение 30 секунд (погружают в стаканчик 2-3 раза).
• Промывают водой.
• Дополнительно окрашивают разведенным фуксином в течение 1-2 минут.
• Сливают краску, промывают водой, обсушивают фильтровальной бумагой, исследуют с иммерсионной системой.

Грамположительные микроорганизмы окрашиваются фиолетовым цветом, не обесцвечиваются спиртом и не воспринимают основной фуксин. Грамотрицательные микроорганизмы обесцвечиваются спиртом и приобретают розово-красный цвет от окрашивания фуксином.

Обнаружение капсул методом негативного контрастирования.

Небольшое количество клеток с твердой питательной среды помещают петлей на предметное стекло в каплю разбавленного фуксина, смешивают с каплей туши, накрывают покровным стеклом и рассматривают под микроскопом. На сером фоне препарата хорошо видны бесцветные капсулы, окружающие клетки микроорганизмов окрашены в розовый цвет.

Окраска эндоспор.

• На фиксированный мазок наливают метиленовый синий (по Леффлеру).
• Краситель доводят до кипения, держа предметное стекло пинцетом над пламенем горелки. По мере испарения красителя его добавляют. Продолжительность окраски трехкратная, по 10-15 секунд.
• Предметное стекло охлаждают и тщательно промывают водой.
• Дополнительно в течение 30 секунд докрашивают 0,5%-ным водным раствором сафранина (или фуксина Циля).
• Краситель сливают, препарат промывают водой, сушат и рассматривают под микроскопом.

При правильном окрашивании вегетативные клетки имеют красный, а споры синий цвет (светло-розовый).

5 этап: Просушивание.

Оставшуюся на стекле после промывания воду осторожно удаляют фильтровальной бумагой, или отсасывая ее краем бумаги, или слегка прижимая кусочек бумаги к мазку. Окрашенный мазок должен быть совершенно сухим, так как остаток воды образует с кедровым маслом, нанесенным на мазок, мутную эмульсию, что мешает микроскопированию.

Приготовление препаратов живых клеток микроорганизмов.

Метод изучения микробов в живом неокрашенном состоянии имеет следующие преимущества:

• Микробы изучаются в неповрежденном виде.
• Наблюдение микробов в живом виде позволяет выявить ряд свойств, не обнаруживаемых у убитых микробов (активная подвижность).

Вместе с тем метод имеет и ряд недостатков:

• Трудность исследования неокрашенных микробов ввиду их малой величины.
• Невозможность длительно сосредоточит внимание на микробе, так как он быстро перемещается из поля зрения.

В живом состоянии микробов исследуют в “раздавленной капле”, “висячей капле” и “отпечатком”, также рассматривают “агаровую пленку”; в некоторых случаях при этом применяют прижизненную (витальную) окраску микробов .

Препарат “раздавленная капля”.

На предметное стекло наносят каплю воды, помещают в нее небольшое количество клеток изучаемых микроорганизмов, размешивают и накрывают покровным стеклом. Микроорганизмы, выращенные и на плоской и в жидкой питательной среде, переносят в каплю воды бактериологической петлей; выращенные в жидкой среде можно переносить так же стерильной пипеткой. При продолжительном изучении микроскопируемого объекта края покровного стекла рекомендуется залить лаком для ногтей, что предотвратит быстрое высыхание препарата (см. приложение рис. 7).

Препарат “висячая капля”.

Каплю суспензии микроорганизмов петлей или обычным пером наносят на покровное стекло, которое поворачивают каплей вниз и помещают на специальное предметное стекло с углублением (лункой) в центре. Капля должна свободно висеть, не касаясь краев и дна лунки. Края лунки предварительно смазывают вазелином. Капля оказывается герметизированной во влажной камере, что делает возможным многодневное наблюдение за объектом. Для длительных наблюдений используют стерильные стекла, а суспензию микроорганизмов готовят в жидкой питательной среде. При работе с бактериями используется редко (см. приложение рис. 8).

Препарат “отпечаток”.

Из агаризованной среды, на которой микроорганизмы растут сплошным газоном или в виде отдельных колоний, вырезают скальпелем небольшой кубик и переносят его на предметное стекло так, чтобы поверхность с микроорганизмами была обращена вверх. Затем к газону или колонии прикладывают чистое покровное стекло, слегка надавливают на него петлей или пинцетом и тот час же снимают, стараясь не сдвинуть в сторону. Полученный препарат помещают отпечатком вниз в каплю воды или метиленового синего (1:40) на предметное стекло. Отпечаток можно получить и на предметном стекле, если касаться поверхности колонии или газона предметным стеклом. Используют в основном при исследовании спороношения стрептомицетов.

Препарат “агаровая пленка” (или “микрокультура”).

На тонкое простерилизованное и нагретое предметное стекло наносят стерильной нагретой пипеткой 0,2-0,3 мл горячей агаризованной питательной среды и распределяют по всей поверхности стекла. После застывания среды удаляют петлей лишний агар, оставляя два тонких участка пленки, величиной с покровное стекло каждый. В центр квадратов бактериальной петлей или пипеткой наносят каплю жидкой культуры или суспензии клеток микроорганизма. Стекло помещают во влажную камеру (чашка Петри со слоем мокрой фильтровальной бумаги), которую ставят в термостат. Перед микрокопированием на пленку с выросшей микрокультурой наносят каплю красителя или каплю воды в случае подсыхания пленки и затем осторожно накрывают покровным стеклом .

Прижизненная окраска микробов.

При работе с раздавленной каплей для лучшей видимости микробов жидкость можно слегка подкрасить, вводя под покровное стекло небольшую каплю красителя. При этом бактерии окрасятся и будут отчетливее видны в поле зрения микроскопа.

1 способ окраски:

• На чистое предметное стекло наносят насыщенный водный раствор метиленовой сини.
• Дают высохнуть.
• Фильтровальной бумагой протирают стекло, пока налет не примет светло-голубого оттенка.
• На предметное стекло наносят каплю исследуемого материала и накрывают покровным стеклом.
• Микробы постепенно окрашиваются в голубой цвет, оставаясь живыми.

2 способ окраски:

Каплю исследуемого материала смешивают на предметном стекле с краской (0,1-0,01%), накрывают покровным стеклом и рассматривают под микроскопом .

Таким образом, мы изучили, какие существуют способы приготовления как временных, так и постоянных микропрепаратов, из каких организмов их можно приготовить. Выяснили, что микропрепараты широко используются во всех биологических науках.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение научной и методической литературы позволило нам сделать выводы о том, что микропрепараты широко используются на уроках биологии и для этого необходимо уметь их изготовлять.

Микропрепараты делят на временные и постоянные. Временные препараты не хранятся, их готовят в ходе лабораторной работы, непосредственно перед изучением объекта. Постоянные препараты могут храниться много лет. В основном их изготавливают промышленным путем, но можно их приготовить и самостоятельно.

К микропрепаратам предъявляют определенные требования по изготовлению, хранению и использованию, которые необходимо соблюдать.

Перед занятием учитель должен проинструктировать учащихся как правильно обращаться с микропрепаратами.

Для приготовления микропрепаратов по биологии необходимы специальное оборудование и инструменты: предметные стекла, покровные стекла, пипетки, чашки Петри, различные колбы, препаровальные иглы, пинцеты, скальпели, спиртовки и др. К оборудованию, используемому при приготовлении микропрепаратов, так же как и к самим микропрепаратам предъявляются требования по хранению и подготовке, которые тоже нужно соблюдать.

Иногда, материал для микропрепаратов нужно зафиксировать и окрасить, для чего используются специальные красители и фиксаторы.

Микропрепараты можно приготовить различными способами. Это и приготовление срезов, мазков, отпечатков, и приготовление микропрепаратов живых клеток организмов (висячая капля, раздавленная капля, отпечаток, агаровая пленка) – все это временные микропрепараты. Материалом для них могут быть различные части растений, ткани, микроорганизмы.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Бавтуто Г.А. Практикум по анатомии и морфологии растений [Текст] / Г.А. Бавтуто, Л.М. Ерей. – М. : Новое издание, 2002. – 464с. : ил.
2. Микробиология [Текст] : методические рекомендации к проведению лабораторных занятий для студентов-биологов / сост. Н. В. Шарыпова.- испр., допол.- Шадринск, 2009. - 47 с., ил.
3. Практикум по анатомии и морфологии растений [Текст] : учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / В.П. Викторов, М.А. Гуленкова, Л.Н. Дорохина и др.; Под ред. Л.Н. Дорохиной. - М. : Академия, 2001. – 176 с.
4. Практикум по микробиологии [Текст] : учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / А.И. Нетрусов, М.А. Егорова, Л.М. Захарчук и др.; Под ред. А.И. Нетрусова. – М. : Академия, 2005. – 608 с.
5. Практикум по физиологии растений [Текст] : учеб. пособие для студ. высш. пед. учеб. заведений / И.В. Плотникова, Е.А. Живухина, О.Б. Михалевская и др.; Под ред. В.Б. Иванова. – М. : Академия, 2001. – 144 с.
6. Суханова Л.В. Тетрадь для лабораторных работ (7-8 класс) [Текст] / Л.В. Суханова // 1 сентября: изд. дом 1 сентября. – 2004. – № 25-26. – С. 36-46.
7. Баринов О.Г. [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://bio.1september.ru/articlef.php?ID=200104304 . - Заглавие с экрана.
8. Википедия [электронный ресурс]. - Режим доступа: http://ru.wikipedia.org/wiki/Микропрепарат - заглавие с экрана.
9. Методические рекомендации [электронный ресурс]. - Режим доступа: http://freecode.pspo.perm.ru/080/work/МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНД АЦИИ. htm - заглавие с экрана.
10. http://labx.narod.ru/documents/micropreparaty.html - заглавие с экрана.
11. Микроскопическая техника в биологии [электронный ресурс]. - Режим доступа: http://labx.narod.ru/documents/microscope_slides.html - заглавие с экрана.
12. Микроскопическая техника в биологии [электронный ресурс]. - Режим доступа: http://labx.narod.ru/documents/prigotovlenie_micropreparatov.html - заглавие с экрана.
13. Сайт учителя биологии [электронный ресурс]. - Режим доступа: http://tana.ucoz.ru/load/436-1-0-354 - заглавие с экрана.
14. Уголок России. Природа Кузбасса [электронный ресурс]. - Режим доступа: http://prirodakem.narod.ru/Biblioteka/My_st/doci/kl_ob.htm - заглавие с экрана.
15. Фирма "Новый лицей" [электронный ресурс]. - Режим доступа: http://novylicey.narod.ru/microprep_3_5.htm - заглавие с экрана.
16. Электронная библиотека ГАГУ(Горно-Алтайский государственный университет) [электронный ресурс]. - Режим доступа: http://elib.gasu.ru/eposobia/papina/malprak1/R_1_2.html - заглавие с экрана.

Приложение

Рис. 1. Положение рук при изготовлении среза (А) и снятие срезов с бритвы (Б)

Рис. 2. Закладка объекта в сердцевину бузины.

Рис. 3. Приготовление микропрепарата.

Накрывание объекта покровным стеклом.

Рис. 4. Схема приготовления мазка крови

Рис. 5. Приготовление препарата-мазка

Рис. 6. Приготовление мазка.

Рис. 7. “Раздавленная капля”: вид сверху и сбоку

Рис. 8. “Висячая капля”: вид сверху и сбоку

→ Как использовать микроскоп →

Вы приобрели свой первый оптический микроскоп , внимательно изучили его конструкцию, а также правила работы с ним. Пора переходить непосредственно к изучению. Что же мы будем изучать? Для изучения любого объекта с помощью светового микроскопа необходимо для начала приготовить микропрепарат.

Микропрепарат может быть временным или постоянным. Для приготовления временного препарата , необходимо на предметное стекло поместить сначала каплю воды (глицерина, раствора, красителя, реактива), а потом в эту каплю поместить уже сам микрообъект. После этого капля накрывается покровным стеклом. Полученный микропрепарат готов к использованию. Такой временный препарат можно использовать повторно в течение нескольких последующих дней при правильном хранении. Постоянные микропрепараты в отличие от временных могут храниться годами, для этого микрообъекты помещаются в специальный бальзам (целлоидин).

Кстати , есть еще одна хитрость - если микроорганизмы, которые используются в препарате в качестве образцов, слишком подвижны, в воду можно добавить 1,5% раствор метилцеллюлозы, который замедлит их движение.

Микропрепараты можно разделить на сухие и влажные. Выше была описана методика приготовления влажного препарата, то есть препарата, в котором образец не может обходиться без воды, чтобы оставаться живым. Что касается сухих микропрепаратов , то для их приготовления не используется вода. На предметное стекло помещается очень тонкий срез образца, который накрывается покровным стеклом. После этого покровное стекло можно слегка придавить (только делайте это в резиновых перчатках, чтобы не оставлять следов).

Иногда при приготовлении микропрепаратов дополнительно используют специальный краситель, так как без окрашивания некоторые образцы очень трудно изучать под микроскопом. Обычно в качестве красителя используется раствор йода и йодида калия (также в ход может идти раствор «метиленового синего» или «кристаллического фиолетового»).

Изучаемые образцы делятся на те, что можно рассматривать под микроскопом целиком (например, споры, пыльцы и другие), и те, для изучения которых необходимо предварительное изготовленные срезов. Микропрепараты, в которых используются образцы целиком, называются тотальными .

Что касается срезов, то они могут быть поперечными или продольными (радиальными, тангентальными, парадермальными). Поперечный срез делается перпендикулярно оси органа, а продольный - по радиусу оси органа. Тангентальный срез делается перпендикулярно радиусу цилиндрической структуры (к примеру, стебля), а парадермальный - параллельно поверхности плоской структуры (например, листа).

Срезы делаются очень острым лезвием, которое все время смачивается водой. Необходимо сделать сразу несколько срезов, из которых потом выбрать самый тонкий и с помощью препаровальной иглы поместить в центр предметного стекла в каплю воды.